硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)是常用的微生物生化鑒定項(xiàng)目，GB 4789系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中涉及的項(xiàng)目有蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種），除此之外，包裝飲用水、化妝品、一次性使用衛(wèi)生用品的銅綠假單胞菌和公共場(chǎng)所空氣和空調(diào)冷凝水、沐浴用水經(jīng)常要檢測(cè)的嗜肺軍團(tuán)菌也涉及硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)。很多小伙伴對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)相對(duì)模糊，且在判定時(shí)候會(huì)有各種疑問(wèn)。這次就跟隨小編來(lái)詳細(xì)了解下，相信看完小編的文章，以后再碰到這個(gè)實(shí)驗(yàn)，一定是手到擒來(lái)！

硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)原理

硝酸鹽還原指硝酸鹽在硝酸還原酶的作用下，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾倪^(guò)程。硝酸鹽還原酶是一種誘導(dǎo)酶，在有硝酸根（NO₃^-）離子存在的條件下，某些細(xì)菌會(huì)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與乙酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘酚結(jié)合生成紅色的N-α萘胺偶苯磺酸。 

　　根據(jù)硝酸鹽還原程度的不同可分為以下幾種情況：

--待檢菌可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，滴加硝酸鹽還原試劑后呈現(xiàn)紅色，判定為陽(yáng)性；

--待檢菌可將硝酸鹽還原為氮?dú)?，則小倒管中會(huì)有氣體囤積，判定為陽(yáng)性；

--待檢菌可將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨，則滴加硝酸鹽還原試劑呈無(wú)色反應(yīng)，此時(shí)需加入適量鋅粉證明培養(yǎng)物中是否有未被利用的硝酸鹽存在，如果加入鋅粉后為無(wú)色則證明無(wú)硝酸鹽，則可判斷為陽(yáng)性；

--待檢菌不利用硝酸鹽，滴加硝酸鹽還原試劑后為無(wú)色，加入鋅粉后變?yōu)榧t色，證明培養(yǎng)物中有未被利用的硝酸鹽被鋅粉還原為亞硝酸鹽產(chǎn)生紅色反應(yīng)，此時(shí)判斷為陰性。

試驗(yàn)方法、培養(yǎng)基和試劑

試驗(yàn)方法：

  將待檢菌接種于硝酸鹽肉湯中（不同標(biāo)準(zhǔn)可能配方有所不同）中，36℃±1℃培養(yǎng)（可根據(jù)鑒定菌株調(diào)整培養(yǎng)條件）24 h后，依次滴加硝酸鹽還原試劑甲、乙液，立即觀察結(jié)果。

培養(yǎng)基：

不同標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基的配方有所不同，主要有三種：硝酸鹽肉湯、緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基和硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基。

試劑：

硝酸鹽還原甲乙液（甲液：對(duì)氨基苯磺酸溶液；乙液：α-萘酚乙酸溶液）；鋅粉。

結(jié)果：

a. 出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。

b. 如欲觀察有無(wú)氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮?dú)馍伞?/span>

c. 如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被分解，可取鋅粉少許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色表明硝酸鹽仍存在；若不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。

化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015）

a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后；c為未變色生化管加鋅粉后

        由于銅綠假單胞菌能將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮?dú)?，所以小?dǎo)管里面會(huì)有氣泡產(chǎn)生；大腸埃希氏菌只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，所以，在滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，大腸埃希氏菌生化管的液體變紅；銅綠假單胞菌生化管里并沒(méi)有亞硝酸鹽，因此不能變紅，但是在銅綠假單胞菌生化管中加入還原鋅粉后，液體不變紅，說(shuō)明已經(jīng)進(jìn)行了硝酸鹽還原反應(yīng)。因此，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)里，銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌的硝酸鹽還原都是陽(yáng)性，只是還原的進(jìn)程不同，所造成的結(jié)果形式也不同。

GB 4789.13－2012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)

注：a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后

        在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，所用生化管為半固體形式，所以既可以觀察動(dòng)力，也可以觀察硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)氣莢膜梭菌和鮑氏不動(dòng)桿菌無(wú)動(dòng)力，因此在生化管里是沿穿刺線生長(zhǎng)，而大腸埃希氏菌有動(dòng)力，所以會(huì)沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)。滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸埃希氏菌生化管顏色變紅，說(shuō)明硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；鮑氏不動(dòng)桿菌沒(méi)有變色，因此加還原鋅粉進(jìn)行確認(rèn)，加入后發(fā)現(xiàn)顏色變紅，說(shuō)明硝酸鹽未被還原，該反應(yīng)為陰性。

GB 4789.14－2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)

注：a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后；c為未變色生化管加鋅粉后

        在這個(gè)實(shí)驗(yàn)里，滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，蠟樣芽胞桿菌的液體變紅，說(shuō)明硝酸鹽還原陽(yáng)性；鮑氏不動(dòng)桿菌和單增李斯特氏菌顏色不變，因此加還原鋅粉進(jìn)行確認(rèn)，加入后發(fā)現(xiàn)顏色變紅，說(shuō)明硝酸鹽未被還原，該反應(yīng)為陰性。

不同細(xì)菌的反應(yīng)差異

不同種類的細(xì)菌在硝酸鹽還原過(guò)程中表現(xiàn)不同：蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸埃希氏菌只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而銅綠假單胞菌則能將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮?dú)?，有些?xì)菌甚至還可以將其還原產(chǎn)物在合成代謝中完全利用。所以，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)既要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷，還要排除其他干擾，而正因?yàn)檫@些差異才使得硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)在微生物分類和鑒定中具有十分重要的意義?。

看完以上內(nèi)容，相信小伙伴們對(duì)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)了，如果對(duì)以上內(nèi)容感興趣的話，就持續(xù)關(guān)注北京陸橋吧！