硝酸鹽還原實驗是常用的微生物生化鑒定項目，GB 4789系列國家標準中涉及的項目有蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種），除此之外，包裝飲用水、化妝品、一次性使用衛(wèi)生用品的銅綠假單胞菌和公共場所空氣和空調(diào)冷凝水、沐浴用水經(jīng)常要檢測的嗜肺軍團菌也涉及硝酸鹽還原實驗。很多小伙伴對這個實驗相對模糊，且在判定時候會有各種疑問。這次就跟隨小編來詳細了解下，相信看完小編的文章，以后再碰到這個實驗，一定是手到擒來！

硝酸鹽還原實驗原理

硝酸鹽還原指硝酸鹽在硝酸還原酶的作用下，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣的過程。硝酸鹽還原酶是一種誘導(dǎo)酶，在有硝酸根（NO₃^-）離子存在的條件下，某些細菌會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與乙酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘酚結(jié)合生成紅色的N-α萘胺偶苯磺酸。 

　　根據(jù)硝酸鹽還原程度的不同可分為以下幾種情況：

--待檢菌可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，滴加硝酸鹽還原試劑后呈現(xiàn)紅色，判定為陽性；

--待檢菌可將硝酸鹽還原為氮氣，則小倒管中會有氣體囤積，判定為陽性；

--待檢菌可將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨，則滴加硝酸鹽還原試劑呈無色反應(yīng)，此時需加入適量鋅粉證明培養(yǎng)物中是否有未被利用的硝酸鹽存在，如果加入鋅粉后為無色則證明無硝酸鹽，則可判斷為陽性；

--待檢菌不利用硝酸鹽，滴加硝酸鹽還原試劑后為無色，加入鋅粉后變?yōu)榧t色，證明培養(yǎng)物中有未被利用的硝酸鹽被鋅粉還原為亞硝酸鹽產(chǎn)生紅色反應(yīng)，此時判斷為陰性。

試驗方法、培養(yǎng)基和試劑

試驗方法：

  將待檢菌接種于硝酸鹽肉湯中（不同標準可能配方有所不同）中，36℃±1℃培養(yǎng)（可根據(jù)鑒定菌株調(diào)整培養(yǎng)條件）24 h后，依次滴加硝酸鹽還原試劑甲、乙液，立即觀察結(jié)果。

培養(yǎng)基：

不同標準規(guī)定的硝酸鹽還原實驗用培養(yǎng)基的配方有所不同，主要有三種：硝酸鹽肉湯、緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基和硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基。

試劑：

硝酸鹽還原甲乙液（甲液：對氨基苯磺酸溶液；乙液：α-萘酚乙酸溶液）；鋅粉。

結(jié)果：

a. 出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。

b. 如欲觀察有無氮氣產(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮氣生成。

c. 如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被分解，可取鋅粉少許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色表明硝酸鹽仍存在；若不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。

化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015）

a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后；c為未變色生化管加鋅粉后

        由于銅綠假單胞菌能將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮氣，所以小導(dǎo)管里面會有氣泡產(chǎn)生；大腸埃希氏菌只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，所以，在滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，大腸埃希氏菌生化管的液體變紅；銅綠假單胞菌生化管里并沒有亞硝酸鹽，因此不能變紅，但是在銅綠假單胞菌生化管中加入還原鋅粉后，液體不變紅，說明已經(jīng)進行了硝酸鹽還原反應(yīng)。因此，在這個實驗里，銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌的硝酸鹽還原都是陽性，只是還原的進程不同，所造成的結(jié)果形式也不同。

GB 4789.13－2012食品安全國家標準　食品微生物學(xué)檢驗　產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗

注：a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后

        在這個實驗中，所用生化管為半固體形式，所以既可以觀察動力，也可以觀察硝酸鹽還原實驗。產(chǎn)氣莢膜梭菌和鮑氏不動桿菌無動力，因此在生化管里是沿穿刺線生長，而大腸埃希氏菌有動力，所以會沿穿刺線擴散生長。滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸埃希氏菌生化管顏色變紅，說明硝酸鹽還原實驗陽性；鮑氏不動桿菌沒有變色，因此加還原鋅粉進行確認，加入后發(fā)現(xiàn)顏色變紅，說明硝酸鹽未被還原，該反應(yīng)為陰性。

GB 4789.14－2014食品安全國家標準　食品微生物學(xué)檢驗　蠟樣芽胞桿菌檢驗

注：a為加硝酸鹽還原甲乙液之前；b為加硝酸鹽還原甲乙液之后；c為未變色生化管加鋅粉后

        在這個實驗里，滴加硝酸鹽還原甲、乙液后，蠟樣芽胞桿菌的液體變紅，說明硝酸鹽還原陽性；鮑氏不動桿菌和單增李斯特氏菌顏色不變，因此加還原鋅粉進行確認，加入后發(fā)現(xiàn)顏色變紅，說明硝酸鹽未被還原，該反應(yīng)為陰性。

不同細菌的反應(yīng)差異

不同種類的細菌在硝酸鹽還原過程中表現(xiàn)不同：蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸埃希氏菌只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而銅綠假單胞菌則能將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮氣，有些細菌甚至還可以將其還原產(chǎn)物在合成代謝中完全利用。所以，硝酸鹽還原實驗既要根據(jù)實驗結(jié)果進行判斷，還要排除其他干擾，而正因為這些差異才使得硝酸鹽還原實驗在微生物分類和鑒定中具有十分重要的意義?。

看完以上內(nèi)容，相信小伙伴們對硝酸鹽還原實驗已經(jīng)有一個全面的認識了，如果對以上內(nèi)容感興趣的話，就持續(xù)關(guān)注北京陸橋吧！